Proteinas II (Dialisis).

Diálisis es la separación de las sustancias que están juntas o mezcladas en una misma disolución, a través de una membrana semi-permeable que las filtra, es decir  una membrana que permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular. De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas.

Es necesario realizar éste proceso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales

MATERIALES: 

• Dializador(gomita elástica,botella cortada, papel celofán)  
• Gelatina en solución
• AgNO3 (Nitrato de Plata)
• Vaso de Bohemia
• CuSO4 al 1 %
• NaOH  al 10%

En agua, tanto el nitrato de plata como el cloruro de sodio se disocian de la siguiente manera:

• AgNO3    H2O       (Ag +) + (NO3-)  (ac)

              Catión Plata     Anión Nitrato

• NaCl     H2O         (Na+) + (Cl -) (ac)

              Catión  Sodio  Anión Cloruro

Para luego:

(Ag+) (ac) + (Cl-)  (ac)      AgCl (s)

Cloruro de Plata

El cloruro de plata es un sólido  blanco, y es su formación lo que determina que el ensayo sea positivo o negativo.

PROCEDIMIENTO:
PARTE1:

1.  Colocar en dos tubos de ensayos muestra de la solución que se pondrá en el dializador.
2. Aplicarle la reacción de Biuret y AgNO3
3.  Registrar lo observado.

OBSERVACIONES: Una vez realizados estos pasos, podemos observar que en ambos casos la reacción dio positiva, porque quedo blanco, por ende la solución tiene sales y proteínas.

PARTE 2:

1. Colocar dentro de un dializador una solución con proteínas y sales
2. Sumergir en un vaso de Bohemia con agua destilada (sin ningún desecho)
3. Luego de algunos minutos, tomar muestras de ambas partes del dializador.
4. Aplicar los ensayos anteriores.
5. Registrar las observaciones.

Vaso de Bohemia que contenía agua destilada:

Biuret	NEGATIVO
AgNO3	POSITIVO

A partir de esto, podemos concluir que si bien el AgNO3 nos dio positivo, por lo tanto denotó la presencia de sales, que anteriormente no había dentro del vaso de bohemia, el ensayo de Biuret nos dio negativo, lo que quiere decir que no detectó proteínas en muestra. Esto prueba que las proteínas no atravesaron la membrana semi-permeable del dializador  


Muestra dentro del dializador:

Biuret	POSITIVO
AgNO3	POSITIVO

Cuando reacciono con AgNO3, la muestra dio positivo, porque contiene NaCl, ésta se disocio obteniendo la presencia de cationes cloruro, que cuando reaccionan con los cationes plata forman AgCl.
El ensayo de Biuret dio positivo, porque el interior contiene gelatina y es una proteína, por lo tanto podemos concluir que las proteinas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semi-permeable del dializador. Esto nos permite concluir que la diálisis funciono.

Proteínas I.

El objetivo de esta experiencia es extraer caseína de la leche para luego reconocer su naturaleza proteica. Para esto utilizaremos los ensayos de Biuret y Xantoproteico y ciertas muestras caseína, glicina, gelatina, ovoalbúmina y aspartamo.

MATERIALES Y SUSTANCIAS:

• Vaso de bohemia • Varilla de vidrio • Mechero  • Soporte • Tela Metálica • Gradilla • Tubos de ensayo

• Termómetro • Papel de filtro • Leche descremada • Ácido etanoíco 2,0M • Hidróxido de sodio al 10% • Sulfato cúprico al 1% • Ácido nítrico concentrado

Reacción Biuret.


La prueba de Biuret es una prueba de producto químico utilizado para la detección de la presencia de enlaces peptídicos. La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico(- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. Ésta reacción da positiva en todos los compuestos que tengan dos o mas enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas. La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea

(H2N-CO-NH-CO-NH2).

Procedimiento: Se coloca aproximadamente 25 mL de leche descremada en un vaso de bohemia, se calienta hasta aproximadamente 40ºC agitando con una varilla de vidrio. Luego se añade ácido etanoico 2,0 M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total. Se separa el coagulo de caseina del suero mediante filtración, y se seca cuidadosamente la caseina con la ayuda del papel de filtro. Finalmente se separa una porción del sólido obtenido de aproximadamente 1cm3 y se coloca en un tubo de ensayo.

Luego de éste procedimiento se agrega sobre cada muestra (caseína - glicina - gelatina - ovoalbúmina - aspartamo) 20 gotas de NaOH al 10%, luego se agregan 2 gotas de solución de CuSO4 al 1%.

Observamos que si a dicha reacción cuando se le agrega el reactivo de sulfato de cobre mas solución de proteína precipito una coloración violeta, por lo tanto esta reacción es positiva, pero cuando la reacción se torna a una coloración azulada, la reacción es negativa, ya que hay presencia de proteínas. 

Reacción Xantoproteica.

Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro.  

Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca. 
La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nitrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido.

CASEÍNA: Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).

La caseína humana es más rica en cistina y glúcidos que la vaca lo que la hace más apropiada para el bebé.

Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.

La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

GLICINA: La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH₂CH₂COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.

GELATINA:La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría. La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas. 

OVOLALBÚMINA: Las proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas, que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos  de glúcidos a la cadena de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovalbúmina, que es una fosfoglicoproteína. 

La ovalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).
La ovalbumina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso 
molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.

ASPARTAMO: El aspartamo es un edulcorante no calórico, es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C. La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con dilusiones hechas en laboratorio de sacarosa 

Procedimiento: Se coloca aproximadamente 25 mL de leche descremada en un vaso de bohemia, se calienta hasta aproximadamente 40ºC agitando con una varilla de vidrio. Luego se añade ácido etanoico 2,0 M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total. Se separa el coagulo de caseina del suero mediante filtración, y se seca cuidadosamente la caseína con la ayuda del papel de filtro. Finalmente se separa una porción del sólido obtenido de aproximadamente 1cm3 y se coloca en un tubo de ensayo. 
Luego de éste procedimiento se agrega sobre cada muestra (caseína - glicina - gelatina - ovoalbúmina - aspartamo) 10 gotas de HNO3 concentrado.                                                                                         

MUESTRA	BIURET	XANTOPROTEICA
• Caseína	+	+
• Glicina	+	-
• Gelatina	-	-
• Ovoalbúmina	+	+
• Aspartamo	-	-

En el caso de la muestra de caseína y ovoalbúmina en ambas reacciones dio positivo ya que hay enlaces peptídicos y también hay presencia detirosina o triptófano. En la muestra de glicina, la reacción Biuret dio positiva pero la reacción Xantoproteica dio negativa, ya que hay presencia de enlaces peptídicos pero no de tirosina o triptófano.. Por último en el caso de la gelatina, y el aspartamo en ambas dio negativo ya que no hay enlaces peptídicos, ni tampoco cuenta con la presencia de tirosina o triptófano.